2024年酶的定向進(jìn)化技術(shù)發(fā)展趨勢 人工智能帶動技術(shù)發(fā)展【組圖】

行業(yè)主要上市公司：金斯瑞(HK.1548)、凱賽生物(688065.SH)、華熙生物(688363.SH)、華恒生物(688639.SH)、川寧生物(301301.SZ)等

本文核心數(shù)據(jù)：酶的定向進(jìn)化原理;高效構(gòu)建突變體庫的新方法;體外突變發(fā);體內(nèi)突變法;高通量定向進(jìn)化的新方法

——酶的定向進(jìn)化原理

酶的定向進(jìn)化，旨在試管中模擬自然進(jìn)化過程，通過提高基因突變率和設(shè)計特殊的篩選、選擇方法，快速獲得擁有特定性能的酶。因此，定向進(jìn)化又被稱為“代替自然選擇的上帝之手”，為試管中的達(dá)爾文主義。酶的定向進(jìn)化通常包括三個步驟：①通過對蛋白編碼序列進(jìn)行隨機(jī)突變、定點突變或重組構(gòu)建基因突變體庫;②定向篩選、選擇以獲得具有改進(jìn)表型的突變體;③以該突變體作為下一輪基因多樣化的起點，進(jìn)行定向進(jìn)化的迭代，直到獲得性能最優(yōu)的突變體。

根據(jù)文庫構(gòu)建原理的不同，蛋白質(zhì)定向進(jìn)化可分為隨機(jī)進(jìn)化、半理性進(jìn)化和理性進(jìn)化三種策略，其大致思路均為由某一靶基因或一族相關(guān)的家族基因起始，通過對編碼基因進(jìn)行突變或重組，創(chuàng)建分子多樣性文庫;篩選文庫獲得能夠編碼改進(jìn)性狀的基因，作為下一輪進(jìn)化的模板;在短時間內(nèi)完成自然界中需要成千上萬年的進(jìn)化，從而獲得具有改進(jìn)功能或全新功能的蛋白質(zhì)。

——高效構(gòu)建突變體庫的新方法

高效構(gòu)建多樣化的基因突變體庫是定向進(jìn)化的關(guān)鍵步驟之一。早期通過化學(xué)試劑(如甲磺酸乙酯、亞硝酸等)或射線對基因進(jìn)行無差別隨機(jī)突變的傳統(tǒng)方法，由于突變率低并且極易造成基因組不穩(wěn)定而逐漸被淘汰。取而代之的是一系列相對可控且有高突變率的體外突變法和體內(nèi)突變法。

——體外突變法

體外突變法主要包括可以產(chǎn)生隨機(jī)突變的易錯PCR(error-prone PCR, epPCR)、DNA改組(DNA shuffling)、可以產(chǎn)生非隨機(jī)突變的定點飽和突變(site-saturation mutagenesis, SSM)、序列飽和突變(sequence saturation mutagenesis, SeSaM)、合成文庫(synthetic library generation)等，這些傳統(tǒng)體外突變技術(shù)成為單個酶定向進(jìn)化的有力工具，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，構(gòu)建體外突變體庫的新方法也不斷涌現(xiàn)。

此外，隨著基因高通量合成技術(shù)及DNA測序技術(shù)的高速發(fā)展，傳統(tǒng)的體外突變法存在的共有缺陷，如密碼子缺乏控制、具有序列偏好性等，在一定程度上被合成文庫法所改善。Twist Bioscience公司與M. Reetz課題組合作，在2018年報道了這種新型的體外突變體庫構(gòu)建方法，即在硅基芯片上應(yīng)用大規(guī)模平行寡核苷酸合成技術(shù)，然后進(jìn)行有效的基因組裝，每種突變體均采用計算機(jī)模擬設(shè)計，并在合成前進(jìn)行篩選，因此消除了不需要的序列偏倚、提前出現(xiàn)的終止密碼子和多余的基序。通過實驗分析，這種通過大規(guī)?；蚝铣蓸?gòu)建突變體庫的方法相比于利用傳統(tǒng)的易錯PCR或飽和突變等方法，具有野生型序列更少、突變體分布比例更均勻、文庫多樣性更豐富等突出優(yōu)勢，有利于下游篩選，目前，該方法已實現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用。

——體內(nèi)突變法

基因突變體庫的另一大類構(gòu)建方法是體內(nèi)突變法，即在胞內(nèi)誘導(dǎo)特定基因的突變，無需進(jìn)行基因克隆與轉(zhuǎn)化，很大程度上縮短了定向進(jìn)化的實驗周期。例如早期開發(fā)的基于單鏈DNA重組的多元自動化基因組工程技術(shù)(multiplex automated genome engineering, MAGE)，是針對大腸桿菌基因組上特定基因進(jìn)行體內(nèi)誘變的重要策略。近年來，CRISPR-Cas介導(dǎo)的重組技術(shù)實現(xiàn)了在原核與真核細(xì)胞中對目的基因進(jìn)行高效的片段插入、刪除和替換，大大提高了原核與真核細(xì)胞中重組的效率，因此也發(fā)展了一批高效的胞內(nèi)蛋白質(zhì)定向進(jìn)化工具。例如將CRISPR-Cas系統(tǒng)和MAGE整合后，基因重組效率由3%提高到98%，插入/替換效率提高至70%;將CRISPR-Cas9與epPCR偶聯(lián)(CasPER)可以向酵母基因組中任意基因的600 bp內(nèi)引入隨機(jī)突變。

注：a—基于CRISPR-CAS9同源重組的突變;b—基于NCAS9和DNA聚合酶I的突變;c—基于NCAS9和堿基編輯器的突變

——高通量定向進(jìn)化的新方法

創(chuàng)建序列覆蓋率高、多樣性強的突變體庫，能最大程度挖掘不同氨基酸序列與其對應(yīng)表型之間的關(guān)系，理論上能夠提高獲得理想突變體的概率。然而，絕大部分篩選和選擇技術(shù)通量低、準(zhǔn)確性差，導(dǎo)致難以實現(xiàn)對目標(biāo)蛋白質(zhì)序列全面且深入的挖掘。因此，開發(fā)更快速、靈敏、準(zhǔn)確的高通量篩選技術(shù)，是提高定向進(jìn)化效率的關(guān)鍵所在。

——新型高通量篩選技術(shù)

在酶分子的定向進(jìn)化過程中，突變體庫的高質(zhì)量以及高通量篩選方法的可靠性，通常是決定其成敗的關(guān)鍵性因素。根據(jù)是否需要篩選標(biāo)記可以將目前普遍應(yīng)用的高通量篩選方法分為兩大類，其中需要標(biāo)記的技術(shù)為平板篩選法、展示法和熒光篩選法，不需要標(biāo)記的技術(shù)為質(zhì)譜法、紅外檢測法和特殊光譜檢測法，以下著重對這些方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

——連續(xù)定向進(jìn)化

連續(xù)進(jìn)化旨在無人為干預(yù)的情況下完成基因突變、蛋白表達(dá)、表型選擇與篩選的迭代實驗。連續(xù)定向進(jìn)化通過縮短每輪的進(jìn)化時間來增加迭代次數(shù)，從而提高獲得目標(biāo)性狀突變體的概率。由D. Liu課題組開發(fā)的噬菌體輔助的連續(xù)進(jìn)化系統(tǒng)(phage-assisted continuous evolution, PACE)是較經(jīng)典的案例。PACE將目標(biāo)蛋白編碼序列引入篩選噬菌體DNA載體中(selection phage, SP)，并通過敲除pⅢ蛋白編碼區(qū)而阻斷噬菌體侵染力，同時將含有pⅢ的輔助質(zhì)粒(accessory plasmid, AP)和提高大腸桿菌基因突變率的突變質(zhì)粒(mutator plasmid, MP)引入大腸桿菌內(nèi)。通過設(shè)計特定的基因回路，將pⅢ的表達(dá)與目標(biāo)蛋白的活性相偶聯(lián)，再通過類似“潟湖”的液路控制系統(tǒng)使得含有目標(biāo)活性突變體的噬菌體迭代富集，從而實現(xiàn)進(jìn)化與篩選自動循環(huán)。由于從噬菌體侵染到再組裝的周期較為短暫，因此PACE系統(tǒng)可以在24 h內(nèi)完成30輪以上的蛋白質(zhì)進(jìn)化，達(dá)到其他定向進(jìn)化手段難以企及的迭代次數(shù)。

——計算機(jī)輔助的定向進(jìn)化

近年來隨著人工智能的高速發(fā)展，借助同源建模與機(jī)器學(xué)習(xí)對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測的準(zhǔn)確性日益增加，不同的算法及軟件被開發(fā)以用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的計算。包括Modeller、Rosetta、AlphaFold 2等在內(nèi)的多種方法已被廣泛用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測。其中，最廣為人知的計算方法為AlphaFold 2，這種算法是通過生物信息學(xué)和物理方法結(jié)合的方法進(jìn)行預(yù)測。

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